人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的分离和培养

1. 将 15-20cm 长的新生儿脐带放入无菌的 PBS 溶液中储存。(注:4℃下最多贮存 24 小时,室温下不超过 6 小时,否则废弃)
2. 用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中,用无菌的 PBS 溶液冲洗 3-5 次,将污血冲洗干净为止。
3. 用手术钳夹紧脐带下端,加入 15ml 的胶原酶(1mg/ml)室温下消化 15-20分钟,并不时上下摇动脐带。
4. 消化完后,将下端手术钳松开,消化液流入一个 50 ml 无菌离心管中,用无菌的 PBS 溶液冲洗脐带 2-3 次。
5. 将收集液离心(2000 转/分)3 分钟。
6. 倒去上清,加入 10ml M199 培养基(加入 10U/ml 的 bFGF),用弯管吹散细胞,将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中,37℃培养。(注:每个培养瓶中加入 3-4ml 无菌的 1%的明胶溶液,摇匀使得明胶溶液完全铺满瓶底,放入 37℃孵育,最少 2 小时,用前将明胶溶液倒了即可,明胶包被有利于细胞贴壁。)
7. 培养 24 小时后,倒掉培养基,并用无菌的 PBS 溶液清洗 2-3 次,洗掉红细胞和死细胞,加入 10 ml 新鲜的 M199 培养基。
8. 以后每 2 天换一次培养基(每次换掉 2/3 的培养基)。
9. 一般培养 5-7 天,细胞可长满至 80-90%单层,这时可以传代。
10. 倒掉培养基,用无菌的 PBS 溶液清洗 2-3 次,加入 2-3ml 消化液(0.25%胰酶+0.1%EDTA)消化细胞,在显微镜下观察,一旦细胞变圆,即加入 2-3 倍的有血清的 DMEM 培养基终止反应。
11. 用弯管将细胞吹打下来,并将所消化的细胞转移到一个 50 ml 无菌离心管中,2000 转/分,离心 3 分钟。
12. 倒掉上清,加入10ml新鲜培基,一般一瓶细胞可传代3-4瓶.以后照此传代培养.
13. 一般传代 2-3 代(培养了 20 天左右)用于做各种实验效果最好。

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