2A肽在蛋白表达中的应用和序列

2A肽(2A self-cleaving peptides)是一类长18-22个氨基酸残基的肽片段,能诱导细胞内含有2A肽的重组蛋白自我剪切。这种肽都有一段的序列模体,经常会在最后甘氨酸(G)和脯氨酸(P)连接处导致核糖体无法连接,从而造成“剪切”的效果。这种肽在很多科病毒中都有分布。2A肽诱导的剪切效率较高,部分情况下,剪切效率可以达到接近100%。现有证据支持转译时2A肽会诱使核糖体在合成至2A肽中断裂处的谷氨酸时,提早将前半段已合成的肽链放出,从而以2A肽为界形成二段多肽,但目前尚不完全清楚这一过程具体的分子机制。

目前一共有4种常用的2A肽:T2A、P2A、E2A、F2A。它们都是以来源的病毒命名的。例如第一种发现的2A肽F2A源于手足口病毒,而手足口病毒的英文名称“foot-and-mouth disease virus”首字母是“F”,因此这种2A肽得名F2A。2A本身源自微小核糖核酸病毒科的基因命名方式。

生物研究用到的2A肽目前一共有4种: P2A、E2A、F2A、T2A。其中F2A源于手足口病毒(Foot-and-mouth disease virus)、E2A源于马甲型鼻炎病毒(Equine rhinitis A virus)、P2A源于猪捷申病毒(Porcine teschovirus)、T2A源于明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus)。

下表罗列了四种2A肽的序列。虽然对2A肽的功能而言不是必要条件,在2A肽序列的N端加上一个GSG(Gly-Ser-Gly,甘氨酸、丝氨酸、甘氨酸)序列能提高2A肽诱导剪切的效率。

种类          序列
T2A (GSG) EGRGSLL TCGDVEENPGP
P2A (GSG) ATNFSLLKQAGDVEENPGP
E2A (GSG) QCTNYALLKLAGDVESNPGP
F2A (GSG) VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP

2A肽在蛋白表达中的应用和序列

DNA引物合成序列

P2A:

5′-CGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTA-3′ (forward)

5′-GATCTAGGTCCAGGGTTCTCCTCCACGTCTCCAGCCTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTAGTAGCTCCGCTTCCGCATG-3′ (reverse).

T2A:

5′-CGGAAGC GGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAAT CCTGGACCTA-3′ (forward)

5′-GATCTAGGTCCAGGATTCTCCTCGACGTCACCGCATGTTAGCAGACTTCCTCTGCCCTCTCCGCTTCCGCATG-3′ (reverse).

E2A:

5′-CGGAAGCGGACAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAACCCTGGACCTA-3′ (forward)

5′-GATCTAGGTCCAGGGTTGCTCTCAACATCTCCAGCCAATTTCAAGAGAGCATAATTAGTACACTGTCCGCTTCCGCATG-3′ (reverse).

F2A:

5′-CGGAAGCGGAGTGAAACAG ACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTGGAGTCCAAC CCTGGACCTA-3′ (forward)

5′-GATCTAGGTCCAGGGTTGGACTCCACGTCTCCCGCCAACTTGAGAAGGTCAAAATTCAAAGTCTGTTTCACTCCGCTTCC GCATG-3′ (reverse).

应用
在基因工程中,2A肽可令一个开放读框(ORF)转译出的肽链分为数个独立的肽链。如果需要令两个蛋白分开表达(例如需要一个蛋白进入细胞核、另一个蛋白在细胞质中表达),又希望只在载体上构建一个开放读框,可在它们的编码区中插入一段2A肽序列。除此之外,如果两个蛋白融合后,融合蛋白没有功能,可以在两个蛋白的编码区中间插入一段编码2A肽的序列,或将连结肽更换为2A肽,使转译完成后两个蛋白分开,独立进行折叠。这样做有很大机会使两个蛋白恢复功能。

IRES同样可以从一个开放读框翻译出两个肽链,但其特性略有不同:由IRES分隔的两段肽链虽在同一个转录本上,但因它们各自独立转译,合成的肽链不会包含IRES序列;另外在IRES上游的肽链表现效率高于位在下游的肽链[12]。相对而言,2A肽本身的序列在剪切后仍然分别存在于上下游的二个产物肽链,在表现效率上,2A肽链上下游的肽链表现量相近。搭配使用2A肽与IRES或是使用多个2A肽均可以在一个开放读框中表达多个重组蛋白。

不完全剪切
不同2A肽序列造成的“剪切”效率各有不同,其中P2A最高,F2A最低。[14]以F2A连接的蛋白质有高达50%会形成融合蛋白,造成获得新功能等意想不到的结果。

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