流式细胞技术实验方法

一、测定用乙醇固定的 DNA 的含量
1、培养细胞的 DNA 含量的测定
制备单细胞悬液于 200μl 的 PBS 缓冲液中；
加入 2ml 预冷的 70%乙醇，4℃保存；
附:细胞固定的一般步骤
1) 取单细胞悬液 1～2×10 6 个细胞于 PBS（PH=7.2）缓冲液中；
2) 300g 离心 5 分钟，弃上清，反复两次；
3) 重悬细胞于 0.5ml PBS 缓冲液中；
4) 将细胞悬液放置于 2～3ml 冷 70%乙醇中，混匀，保存于 4℃，至少 30 分钟。
在 4℃条件下可保存 2~3 周。
注意：
 根据实验的要求，固定剂也可选用 1～3%多聚甲醛；
 将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至 0～4℃；
 细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。
 300g 离心 5 分钟，去上清，再重悬于 400μl PBS 中；
 显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤；
 加入 PI（含 Rnase），避光孵育 30 分钟；
 上机检测。
2、新鲜组织的 DNA 含量的测定
1) 用 200mg 湿重组织用机械法制成单细胞悬液；
2) 500g 离心 5 分钟；
3) 弃上清，重悬于 10ml 染色-去污剂中；
4) 再过滤，用 200 目的筛网或 70~80μm 的筛网过滤；
5) 上机检测。
3、石蜡包埋组织切片的 DNA 含量的测定
1) 从石蜡包埋切取切片 50 μm 厚，2~3 片，制成单细胞悬液；
2) 用 PBS 缓冲液洗涤，500g 离心 5 分钟，弃上清；
3) 加入 PI 液 1ml 室温避光 30 分钟；
4) 调整细胞浓度为 1×10 6 /ml；
5) 上机检测。
二、细胞凋亡检测及相关分子检测

1、细胞 DNA 含量分布（由细胞 DNA 降解方式检测细胞凋亡）
收集已固定的单细胞悬液约 5×10 5 ~1×10 6 /ml；
离心除去固定液，3ml PBS 重悬细胞;
1500rpm 离心，5 分钟 ，弃去 PBS；
加 PI 染液 1ml，室温避光 20 分钟；
调整细胞浓度 5×10 5 /ml；
上机检测。
2、磷脂酰丝氨酸外翻分析检测细胞凋亡
1) 常 规 制 备 单 细 胞 悬 液 , 用 PBS 洗 两 次 .( 若为全血要先溶血),取约 5×10 6 个细胞，1500rpm离心,弃上清,用 400μl 1×Binding Buffer 重悬；
2) 分成 a、b、c、d、e 五管，每管约 1×10 6 个细胞
a) 阴性对照，不加任何试剂；
b) 阳性对照,加 2%多聚甲醛固定 30 分钟,加 AnnexinV 5μl,室温 10min,用1×Binding Buffer 洗一次,弃上清再加 190μl 缓冲液、10μl PI 避光 15 分钟
c) 加 10μl PI，避光孵育 15 分钟；
d) 加 5μl AnnexinV 液，室温避光孵育 15min；
e) 加 10μl PI 和 5μl AnnexinV 液，室温避光孵育 5min；
3) 每管各加 400μl 1×Binding Buffer。
4) 上机检测。
注意 a. 操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞；
b. 操作时注意避光；
c. 反应完毕后尽快检测，最好在一小时内检测。
3、用单克隆抗体 APO2.7 检测细胞凋亡
1) 放置 0.5~1×10 6 个细胞到试管中；
2) 室温离心 200g，6min；
3) 弃上清，加入 100μl 冷的（4℃）在 PBSF 溶液中含 100µg/ml 的digitonnin，轻轻地重悬细胞，在冰上孵育 20min；
4) 加入 2ml 冷的（4℃）PBSF 液，室温离心 200g，6min；
5) 弃上清，加入 20μl PE 标记的 Apo2.7 单克隆抗体和 80μl PBSF 液，用vortex 轻轻震荡，室温避光孵育 15 分钟；
6) 加入 2ml PBSF 液，室温离心 200g，6min；
7) 弃上清，加入 1ml PBSF 液重悬细胞；
8) 避光保存，直到流式细胞仪检测。
PBSF：含 2.5% FCS（v/v）和 0.01%NaN3（w/v）的 PBS。

三、用流式细胞术进行 DNA 周期分析

1、方法：同 DNA 含量检测
2、注意：
单细胞浓度应约 10^6 /ml，以免影响检测的 CV 值和检测结果；制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质量（如细胞是否聚集或过多碎片），以保证得到足够的细胞含量；
醛类固定会影响 PI 与核酸的结合。

四、免疫荧光标记法
1、细胞膜上的免疫荧光检测法
间接标记法
1) 制备单细胞悬液；
2) 细胞计数，取出 1×10 6 个细胞于试管中；
3) 用台盼蓝染色计活细胞数，要求活细胞数 >90～95%；
4) 在试管中加入一抗，（剂量按照说明书的要求），孵育 30～60 分钟；
5) PBS 洗涤 1～2 次，1500rpm，离心 3 分钟，弃上清；
6) 加入二抗，孵育 20～30 分钟；
7) PBS 洗一次，1500rpm，离心 3 分钟，弃上清;
8) 加 300μl PBS，上机检测(若不能及时上机检测，可加 1ml 1%多聚甲醛固
定，可放置 1 周)。
直接标记法
①～③同间接标记法
④在试管中加入荧光标记的抗体，混匀，孵育 30 分钟；
⑤用 PBS 洗 2 次，1500rpm，离心 3 分钟，弃上清;
⑥加 300μl PBS(PH=7.4)，上机检测。
2、 细胞膜内的免疫荧光标记法
间接免疫荧光标记法
1) 取已制备好的单细胞悬液，用 1～3%的多聚甲醛固定 30 分钟（也可 4℃保存过夜）；
2) 用 PBS 洗两次，弃上清；
3) 细胞膜打孔，加入 0.1%皂素 200μl，室温 10 分钟；
4) 用 PBS 洗涤两次；
5) 加入第一抗体，室温 30～60 分钟，或 4℃过夜，同时须设阴性对照或同型对照管；
6) 用 PBS 洗涤两次；
7) 加入二抗（荧光标记的抗体）室温 20 分钟，避光；
8) 用 PBS 洗涤 1～2 次，弃上清；
9) 重悬细胞于 500μlPBS 中，上机检测。
直接荧光标记法
①～⑤同间接荧光标记法；
加入荧光素标记好的抗体，避光 30 分钟（同时做同型对照管）；
用 PBS 洗涤１～２次，弃上清；
加 300μl PBS 上机检测。
细胞膜上及细胞内双标记法（直标法）
1) 取出已制备好的未固定的单细胞悬液 1×10 6 个细胞于试管中；
2) 用 PBS 洗涤两次；
3) 加入用荧光素标记的抗体来标记细胞膜上的抗原，同时加上阴性对照管，室温孵育 20 分钟；
4) 在试管中加入 1％～3％多聚甲醛 1ml，固定 30 分钟；
5) PBS 洗涤两次 1500rpm 3 分钟，弃上清;
6) 打孔，加入 0.1％皂素 200μl 室温 10 分钟;
7) 用 PBS 洗涤两次，弃上清;
8) 加入用荧光素标记的抗体，标记膜内的抗原（标记膜内的抗体的荧光素的颜色与膜上标记的荧光素的颜色务必不相同）室温 20 分钟孵育;
9) 用 PBS 洗一遍弃上清；
10) 用 300μlPBS 重悬细胞，上机检测
五、流式细胞术中的几点注意事项：
1、对照组的设置：
在流式细胞术中所测得的量都是相对值，不是绝对值。如需知道绝对值时必须设置对照组样品。对照组样品包括有阴性对照和阳性对照。
（1）、阴性对照的设置
在实验过程中，如做间接标记法，可设置与一抗无关的实验，即在实验中不加一抗而只加上带有荧光标记的第二抗体作为阴性对照管，作为阴性对照。
在实验过程中，假设做直接标记法，可设置理论上的阴性细胞作为阴性对照管，实验过程及步骤与实验组务必相同。（做间接标记法时，同样也可同时设置“阴性细胞”的阴性对照管作为阴性对照。
在实验过程中，假设做直接标记法，可将实验组细胞，取一管，加上与实验抗体所标记的荧光颜色相同的同型对照来作为阴性对照。
（2）、阳性对照的设置：
在实验过程中如涉及到表达缺失或减少的实验，应设置阳性对照组，其设置方法与阴性对照设置相同。
2、几点建议：
1) 在实验过程中，在保证实验的科学性和准确性的基础上，应尽量减少实验工序和过程。由于间接标记法的工序多，实验过程长，如再加之操作的不熟练，细胞更容易丢失和受损，而造成实验结果的误差。因此，在条件允许的范围内，建议尽量做直接标记法而不去做间接标记法，以保证实验的真实性和准确性。
2) 建议送检细胞一定要足够量，一般要求 1×10 6 个细胞。不要过少。因为，如细胞太少检测时样本流量相对会增大从而影响变异系数，结果也不可信。细胞量也不宜过多，因细胞量太多加入的抗体或染料相对不足，结果也由此受影响。
3) 同一种细胞需同时做双标记时，须做双标记的同型对照，且两种抗体所标记的荧光颜色务必不同。