FACS:细胞染色背景高、特异性低如何处理

如何固定和渗透细胞(小鼠和人类)以进行特异性细胞内染色:

1: 我们常规使用的一种廉价而有效的方法是用 10%缓冲福尔马林溶液在 4°C 下固定 15-30 分钟,然后用 TBST(0.2% TritonX-100)在室温下透化细胞 20 分钟。如果您的细胞或您要染色的抗原比较棘手,您可以购买市售的固定和通透试剂盒,如 BD Bioscience。
2:有几种固定和通透的方法可供选择。传统的多聚甲醛不能用于同时进行 DNA 染色。
3: 测试不同的固定/通透缓冲液和试剂盒。有些是为染色转录因子和核蛋白设计的,有些则是为细胞质蛋白设计的。确保在适当的缓冲液(如渗透缓冲液)中配制抗体鸡尾酒,如果使用 BD 公司的多种 Brilliant 染料,则使用 BD Brilliant 染色缓冲液,但要测试哪种方法效果最好。
4: 尝试使用含saponin-perm溶液,处理后离心洗去溶液,然后用含saponin-perm缓冲液清洗两次。确保使用了适量的试剂(正确滴定)
这主要取决于您要检测的标记。我会尝试不同的固定/烫印体系来筛选标记物,看看是否有效果更好的。您也可以尝试在透化后进行阻断,例如使用更大量的血清(筛选不同的抗体克隆/格式,选择适合您目的的抗体)。
试剂滴定是避免本底过高的关键,在信号过低的情况下,必须确认所选的荧光色素是否与缓冲体系兼容。此外,某些细胞内靶表位在某些缓冲液体系中可能比在其他缓冲液体系中保存得更好。请务必使用新鲜制备的缓冲液,并遵循孵育指南(温度和时间)。

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