人外周血 T 细胞分离方法

本节介绍从全血中分离外周血单个核细胞 (PBMC) 和pan T 细胞富集的方法。在分离 PBMC 时，可以使用多种不同的来源样品（如：全血、血沉棕黄层、白细胞减少系统室等）。

注意：所有步骤都应在层流环境中进行，使用适当的无菌技术。
1.确定要处理的全血量。
2.计算需要的 T 细胞数量。
3.使用密度梯度离心法分离 PBMC。
4.加入一份 PBS 稀释全血。用血清移液管轻轻混合。
5.将 15 mL 的密度梯度介质（如 Histopaque-1077等）分装到无菌的 50 mL 锥形管中（每管可处理 35 mL 的稀释血液）。
6.小心地将稀释的血液分层加到密度梯度介质上。最好将试管保持在 45°角，用移液器吸头靠在试管一侧并缓慢释放稀释的血液。
注意：注意不要破坏密度梯度介质和稀释血液之间的层。时间较长的话，一些红细胞可能在离心之前就已经沉降到试管底部，这是正常的。
7. 20°C 下以 1,000 × g ，离心20 分钟。
8.使用血清移液器小心地将PBMC 层（如下图），转移到新的 50 mL 锥形管中。加入PBS ，然后在 20°C，520 × g ，离心 15 分钟。
9.吸出上清液并丢弃。将细胞颗粒重新悬浮在 5 mL 的 PBS 中，将同一供体的 PBMC 汇集到同一个 50 mL 管中。并使用血细胞计数器或自动细胞计数器记录 PBMC 的细胞计数。
10.通过磁柱富集法分离总 T 细胞。

T细胞的磁柱分选：

1.在 20°C ， 520 × g 离心 10 分钟。
2.吸出上清液并丢弃。每 107 个细胞在 80 μL 的冷 MACS 缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。
3.通过涡旋 15 s 彻底重悬 CD3 微珠，每 107 个细胞添加 20 μL 的磁珠。充分混合样品。在 4°C ，孵育 15 分钟。
4.每 107 个细胞加入 2 mL 预冷的 MACS 缓冲液， 4°C ， 300 × g 离心10 分钟。
5.将 LS 柱连接到兼容的 MACS 分离器上，为细胞分离做准备。在柱下放置一个 50 mL 锥形管以捕获液体，并将 3 mL 的冷 MACS 缓冲液加到柱上。
6.离心完成后，吸出上清液并丢弃。在 500 μL 的冷 MACS 缓冲液中重新悬浮细胞。每超过前 108 个细胞的 107 个细胞再添加 50 μL 缓冲液。
7.将细胞悬浮液加载到准备好的 LS 柱上。
8.在它流过后，用 3 mL 的冷 MACS 缓冲液彻底清洗色谱柱。再重复此步骤两次。
9.丢弃流过的液体，并在柱下放置一个新的 50 mL 锥形管。
10.应用 5 mL 的冷 MACS 缓冲液，然后立即放在柱塞上。保持适度的连续推动以恢复标记的泛 T 细胞。
11.添加 25 mL 的冷 MACS 缓冲液并执行细胞计数。

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