MFI: 用image J测量计算荧光染色的mean fluorescence intensity

1、加开图像后,提取出单一通道(Image-Color-Split Channels)

2、调整阈值,选择适当的区域(Image-Adjust-Threshold)

注意:

  1. 如果图片上有比例尺,必须调节Threshold,或者框选比例尺的区域Edit-Fill,从而去掉比例尺,否则会影响结果。
  2. 务必用Red来表征选中区域。
  3. 荧光图片的背景通常是黑的,所以需要勾选Dark Background!!
  4. 不用点击Apply、Set等按键,红色部分其实已经选中了。

另外,不同Threshold算法会带来不同的结果,如果默认算法(Default)设定的阈值不符合要求,需要重新选择算法。

3、选择合适阈值算法(Image-Adjust-Auto Threshold)

4、设定需要测量的参数(Analyze-Set Measurements)

5、测量(Analyze-Measure):点击Measure后弹出检测结果:

Mean即为平均荧光强度。(Mean即Mean gray value,等于IntDen/Area),IntDen=Integrated Density(荧光强度总和)

可以将结果复制到Excel或者直接导出生成csv文件(Results窗口-File-Save as)
免疫荧光是半定量分析,平均荧光强度只能半定量地表征特异性蛋白的表达

主要是因为免疫荧光实验中的人为因素太多,例如拍照时的曝光、焦距等等,而且非特异性结合的因素也不能完全消除。所以我们在拍照的时候,以及处理数据的时候,一定要有一个固定的标准和流程,从而减小误差。

注意:平均荧光强度并不等于免疫组化中的光密度(Optical Density),所以不需要Invert以及Calibration。单位可以用Arbitrary Units(AU)。

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