染色质免疫共沉淀技术ChIP实验原理和方法

染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)

概述:

真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, CHIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。CHIP不仅可以检测体内反式作用因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,CHIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见,随着CHIP的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

目的:

研究体内蛋白质与DNA相互作用。

原理:

在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来。

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

步骤:

一、细胞的甲醛交联与超声破碎( 第一天)

  1. 取出1平皿细胞(10 cm平皿),加入37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%;
  2. 37 C°孵育10 min;

3.加甘氨酸终止交联;

4.细胞刮刀收集细胞;

5.加入蛋白酶抑制剂复合物和SDS Lysis Buffer;

6.超声破碎 。

二、除杂及抗体孵育 ( 第一天)

1.超声破碎结束后,离心去除不溶物质;

2.加抗体做为实验组;不加抗体做为对照组;加入终浓度为0.2 M NaCl解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果;

3.在超声破碎产物中,加入ChIP Dilution Buffer和50×PIC再各加入Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4 C°颠转混匀;

  1. 1 h后,在4 C°静置10 min沉淀,700 rpm离心1 min;
  2. 取上清,各留取20 μl做为Input。一管中加入1 μl抗体,另一管中则不加抗体。4C°颠转过夜。

 三、检验超声破碎的效果 ( 第一天)

  1. 取100 μl超声破碎后产物,加入4 ul 5M NaCl,解交联;

2.分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果;

四、免疫复合物的沉淀及清洗( 第二天)

  1. 孵育过夜后,每管中加入Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4 C°颠转;
  2. 4 C°静置除去上清;

3.清洗沉淀复合物;

4.清洗完毕后,开始洗脱;

5.解交联:每管中加入终浓度为0.2 M的NaCl;

6.混匀,65 C°解交联过夜。

五、DNA样品的回收(第三天)

  1. 解交联结束后,加入RNaseA(MBI),37 C°孵育;
  2. 每管加入0.5 M EDTA, 1M Tris-HCl(PH6.5),10 mg/ml蛋白酶K。45 C°处理2 h;
  3. DNA片段的回收——Promega胶回收试剂盒。最终的样品溶于 ddH2O;

六、PCR分析(第三天)

流程图:

染色质免疫共沉淀技术ChIP实验原理和方法

如若转载,请注明出处:https://www.ouq.net/264.html

(0)
打赏 微信打赏,为服务器增加50M流量 微信打赏,为服务器增加50M流量 支付宝打赏,为服务器增加50M流量 支付宝打赏,为服务器增加50M流量
上一篇 03/26/2020 01:41
下一篇 03/30/2020 21:59

相关推荐

  • 实验方法总结(3):动物模型部分

    从肿瘤起源分,肿瘤动物模型的分类如下: 从研究目的来分,可以从增殖、转移、耐药三个角度来分析: 1、研究肿瘤细胞增殖 细胞准备:GeneA敲减慢病毒感染细胞扩增至需要的细胞量。分为:空白对照组、阴性对照组、实验组。 取Balb/c裸鼠,雄性…

    03/24/2020
    277
  • 2023年国自然集中接收项目初审不予受理重点原因

    1.未按要求提供证明材料、推荐信、导师同意函、伦理委员会证明等2.不属于项目指南资助范畴3.申请代码或研究领域选择错误4.申请书缺项5.申请人不具备该类项目的申请资格6.申请人或主要参与者申请超项7.其他可认定的不予受理情形8.研究期限填写…

    基金申请 03/05/2024
    191
  • 凝胶迁移或电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)

    凝胶迁移或电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA) 概述: 凝胶迁移或电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)是一种研究…

    03/30/2020
    531
  • 基金委:国自然项目初审不予受理的七大原因

    基金委总结出七个原因导致初审时不予受理,原因如下:   1. 未按要求提供证明材料、推荐信、导师同意函、伦理委员会证明等。 2. 研究期限填写错误。 3. 不属于项目指南资助范畴。 4. 申请代码或研究领域选择错误。 5. 申请人不具备该类…

    02/08/2023
    225
  • 2023年国家自然科学基金申报关键问题问答

    1.重点推荐: 基金培训系列视频 | 2022年集中接收项目申请初步审查不予受理的主要原因 观看链接http://video.nsfc.gov.cn/index230107.html。 视频动画:学术不端警示教育系列动画 观看链接:http…

    基金申请 02/16/2023
    286