实验方法总结(3):动物模型部分

从肿瘤起源分,肿瘤动物模型的分类如下:

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从研究目的来分,可以从增殖、转移、耐药三个角度来分析:

1、研究肿瘤细胞增殖

细胞准备:GeneA敲减慢病毒感染细胞扩增至需要的细胞量。分为:空白对照组、阴性对照组、实验组。

取Balb/c裸鼠,雄性,6周龄,每组10只,适应一周后进行肿瘤细胞注射。XXX细胞消化离心后制成单细胞悬液,计数后取适量的细胞用PBS悬浮,在Balb/c裸鼠侧腹部皮下接种。每只接种2×106个细胞,注射体积为100 μL。此后,每隔5天测量注射部位肿瘤的体积。30天后裸鼠小鼠腹腔注射80 mg/kg戊巴比妥钠,小鼠麻醉后置蓝色背景布上拍照(侧卧位,接种部位朝上),小鼠颈椎脱臼处死,取出肿瘤称重,将肿瘤置蓝色背景布上拍照,肿瘤一分为二,一份4%多聚甲醛固定,待后续病理分析,一份-80℃冻存。

2、研究肿瘤细胞转移

肿瘤转移的模型包括两大类:体外(浸润模型)和体内(转移模型)。体外(浸润模型):了解肿瘤细胞对周围相连组织的侵润性。体内模型主要研究肿瘤细胞的转移性即肿瘤细胞在远端组织形成病灶的能力。

2.1. 体外(浸润模型)

例:浸润型脑胶质瘤动物模型的建立

方法:取若干只Balb/c免疫缺陷裸鼠,将分离和鉴定并转染携带绿色荧光蛋白的脑胶质瘤干细胞立体定向法行小鼠颅内接种,每组10只。小鼠麻醉后头部正中切口,剥离骨膜后钻孔(坐标是冠状缝后0.5 cm,矢状缝右侧2.5 cm) 。取2 μL胶质瘤干细胞以1×104 cells /只小鼠的剂量,经微量注射器缓慢注射入鼠脑纹状体内(深度是2.5 ~3 mm) 。在确定的时间点处死一部分动物进行荧光( 立体荧光显微镜下) 病理证实和比较,同时检查脑胶质瘤干细胞的体内生长特征以及干细胞标志物等。

2.2. 体内(转移模型)

例:肩胛部皮下接种的方法建立裸鼠乳腺癌移植瘤模型,目的:观察壮骨镇痛胶囊对裸鼠乳腺癌移植瘤模型骨转移相关指标整联蛋白αvβ3(ITG-αvβ3)及骨唾液酸蛋白(BSP)表达的影响。

方法:取处于对数生长期的乳腺癌细胞MDA-MB-231,用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,收集细胞,细胞计数板法计数,调节细胞浓度为2×107个/mL,按0.2 mL/只接种于裸鼠右前肢肩胛上区,接种部位可以见一皮丘,质软,2 天后,皮丘基本吸收,10 天后接种部位可触及米粒大结节,质硬,即乳腺癌移植瘤组织。检测壮骨镇痛胶囊对移植瘤组织中IGT-αvβ3和BSP表达的影响。

例:原位移植建立人肾透明细胞腺癌裸鼠转移模型,观察肿瘤病理学特征。

方法:收集体外培养的对数生长期786-0细胞(人肾透明细胞腺癌细胞),进行裸鼠皮下注射,待皮下移植瘤长至直径为1.5cm左右时取出,以相同方法进行鼠间传代(每代2只),3~4代后取出移植瘤,剪成1mm3大小进行肾包膜下原位接种,获人肿瘤裸鼠转移模型,即外科原位移植(Surgical Orthotopic Implantation,SOI)模型,裸鼠垂死时脱颈处死,取出肺脏转移灶体外培养,胰酶消化传代4~5次后即获得较纯的肿瘤细胞,命名为786-0-LM1。同时采用786-0细胞悬液进行肾包膜下原位注射,建立细胞原位注射模型。

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3、研究肿瘤细胞耐药

3.1. 耐药细胞株的建立

本实验以紫杉醇为诱导药,以人食管鳞癌细胞系 EC109 为诱导对象,采用高剂量间歇诱导结合时间递增的方法建立耐药细胞株。终浓度为0.625 μg/ml 的紫杉醇(此浓度是紫杉醇对 EC109 细胞 IC50 的 12.5 倍)作用于对数生长期的EC109 两个小时,之后弃含药培养基,用 4℃PBS 洗三次,0.25%胰蛋白酶消化处理,800r/min 离心 4min 收集细胞,加培养基重悬,重新接种于培养瓶继续培养;24 小时后可见大量细胞死亡,不断去除凋亡细胞,扩增活细胞,至生长状态良好,达到 70%~80%饱和时,传代培养 3 代;重复上述操作两次,即 EC109细胞在此阶段共被药物作用 3 次,得到细胞EC109/Taxol。MTT 实验测定亲本细胞与耐药细胞对多种细胞毒类化合物的敏感性。

3.2. 裸鼠移植瘤耐药模型的建立

无菌条件下收集亲本株 EC109 和 耐药株EC109/Taxol 细胞,用无菌生理盐水稀释至 5×107个/ml,采用皮下移植方法,分别接种EC109 和 EC109/Taxol 细胞于裸鼠右侧腋窝皮下,每只接种 1×107个细胞。待其成瘤后(直径达 1cm)即认为此瘤块为肿瘤,记录两细胞成瘤时间及成瘤率。

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