流式细胞仪(FACS)原理及其应用注意事项

流式细胞术(FCM)定义:

 FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术

特点: 单细胞的流动的, 活细胞定量的,多参数的,高统计学精度的,分选细胞。

流式细胞仪(FACS)原理及其应用注意事项

 (一)仪器基本组成结构

1液流系统 样品流和鞘流

 2光学系统 激光、透镜组、

    光电倍增管等。

 3数据处理系统

流式细胞仪(FACS)原理及其应用注意事项

液流系统

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工作原理

流式细胞仪(FACS)原理及其应用注意事项

2光学系统

流式细胞仪(FACS)原理及其应用注意事项

当物质受到强烈激励,使某一能级的粒子数大量积聚,发生粒子数反分布.如有光束入射,入射光子与粒子发生完全弹性碰撞,使粒子从激发态跃迁到基态同时发生1个光子.光子的能量与入射光子能量相同,有一致的方向和恒定的位相关系,这种发射称受激发射

二 散射光的测定

(一)前向散射光 (foword scatter)FSC   信号的强弱与细胞的大小相关

(二)侧向散射光(side scatter)SSC  信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关

细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.

前向散射光FS: 反映颗粒的大小

侧向散射光SS: 细胞内部结构复杂程度

荧光FL: 细胞被染上荧光部分数量的多少

前向散射光原理:

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侧向散射光原理:

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   利用前向角和测向角散射光可以把外周血白细胞分成三群,淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。

流式细胞仪(FACS)原理及其应用注意事项

 

三 荧光测量

荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长

(一)光信号测量  线性放大器          对数放大器

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常用荧光通道和波长

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四 MACS-Magnetic Cell Sorting 磁珠分离

流式细胞仪(FACS)原理及其应用注意事项

分选技术要求

1 分选速度:几千个细胞/

2 分选纯度:99.5%左右

3 分选收获率:90-95%

4 分选得率

分选纯度 是指分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比。 

分选收获率是指分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。

5.样品制备

5.1外周血淋巴细胞样品的制备

淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞。

Ficoll,40kd,高密度,低渗透压,无毒性。(比重为1.0177±0.001的分层液).

利用红细胞裂解液去除红细胞后,得到外周血中所有白细胞的流式细胞分析的二维散色光点图

5.2 单细胞悬液的保存

防止细胞自溶,保持细胞膜原有的特性保存的方法:

1、深低温保存法:深低温冰箱,保存一年。

2、乙醇与甲醇保存法:70%冷乙醇、75%的甲醇。

3、甲醛或多聚甲醛固定法:细胞不具有生物活性,但

   细胞表面荧光染色分析不受影响。

三、流式细胞免疫学技术的质量控制

(一)单细胞悬液制备的质量控制

(二)细胞悬液免疫荧光染色的质量控制

    1、温度对荧光染色的影响

    2pH对荧光发射强度的影响

    3、荧光染料浓度的控制

    4、固定剂对荧光染色的影响

免疫检测的质量控制

1、同型对照:选用相同源性的未标记单抗作为

同型对照(阴性对照)

  2、全程质控:在流式检测中,样品标记、溶血、

洗涤、仪器质量控制和上机检测的过程都会直接影

响检测结果。采用标准质控样品来进行全程质控,

使得同类实验室建立质控比对,数据可以互用。

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