STAMP:微生物物种与功能组成的可视化软件

STAMP是一款分析微生物物种与功能组成的可视化软件，STAMP 1.0于2010年发表在Bioinformatics杂志，后期2014年的2.0版本同样在Bioinformatics发布，目前最新版本为2.1.3。该软件除了能够绘制探索性数据分析的降维、相关图之外，还提供了假设检验的差异比较统计分析功能。此外，STAMP采用了图形化界面，对用户比较友好

STAMP的输入文件

STAMP允许导入制表符分隔（tab-seprarated）的文件，也可以与主流生信软件如QIIME、Mothur等对接（通过Fife–Create profile from…实现）。文件包含层级注释组成表和样本信息表两部分，文件第一行为表头，含有注释信息的列应当是从最高级到最低级排列，且必须形成严格的树型结构。鉴于目前很多的分类分级系统（包括GreenGenes和SILVA等流行的分类法）的标签错误以及其他一些问题，STAMP网站提供了checkHierarchy.py脚本，可用于识别STAMP配置文件当中所有的非层级条目。而对于未知的条目，应记为unclassified（不区分大小写）。STAMP对于读取计数的形式没有特殊要求，可以为整数或任何实数，这使得标准化的方法可以不止一种。考虑到生物学数据低准确度、低精密度的特点，对于样本数量，STAMP的作者没有建议最小的样本数量，具体的数量应当由样品本身决定，但如需进行假设检验则必须符合相应的数据分布。

图. 输入文件1.层级物种或功能组成表

STAMP允许通过元数据（metadata）文件定义与样本相关联的其他数据。这一文件也应当是制表符分隔的文件。该文件的第一列表示每个样品的名称，并与STAMP配置文件中的样本名称一一对应，其他列可以指定为与该样本相关的任何其他数据。

图. 输入文件2.样本元数据

STAMP的假设检验

关于假设检验，STAMP提供了对多组、两组和两样品的统计检验方式，以及与之相应的事后检验 (Post-hoc test) 、置信区间和多重检验等。对于多组、两组以及两样品的假设检验方法分别如下面表1、表2和表3所示。对于多组样品，作者推荐使用ANOVA进行假设检验，两组样品则建议使用Welch’s t-test这一适用性更广泛的检验方式，同时建议使用Fisher精确检验应对两样品比较的情况。多重检验校正方面，可以选择传统的Benjamini-Hochberg方法，但作者更偏向使用Storey’s FDR。这一方法的计算量更大，效果较Benjamini-Hochberg也更好。

统计假设

方法	描述
ANOVA	方差分析(analysis of variance)的缩写，用于检验多组均值是否相等的方法。可被认为是可分析多组的t-test
Kruskal-Wallis H-test	无参数的秩合检验方法，检验多组的中位数是否相等。它考虑样品排序位置而不是真实数值或比例。它不基于数据是正态分布的前提。此方法要求每组至少5个样本。

事后检验

方法	描述
Games-Howell	当ANOVA产生了显著P值后，检验具体哪两个均值显著不同。用于组样本和方差不同。当方差不同，组样本量小时推荐使用Tukey-Kramer方法
Scheffe	考虑所有可能的比较，而Tukey-Kramer只考虑成对均值。此种方法较保守
Tukey-Kramer	用于ANOVA显著后进一步成对比较。考虑所有可能的均值队，并考虑多次比较的错误率控制。推荐使用Games-Howell输出最终结果，而Tukey-Kramer用于探索分析。推荐此方法的另一个原因是此法使用广泛，被研究者所熟知。
Welch’s(uncorrected)	只是成队均值比较，但不进行多次比较的错误率控制

多重检验校正

方法	描述
Benjamini-Hochberg FDR	控制假阳性率FDR
Bonferroni	控制整体错误率的经典方法，被批评太保守
Sidak	在整体错误率控制中使用不多，但均匀分布数据上比Bonferroni更强，但需要假设个体检验是独立的
Storey’s FDR	控制FDR的新方法，比BH更强。需要估计一些参数和更多的计算资源。

表1：STAMP提供的对于多组样本的假设检验、事后检验与多重校正方法。其中加粗为推荐方法，翻译自STAMP 2.1.3帮助文档第14页。

统计假设

方法	描述
t检验	T检验，亦称student t检验（Student’s t test），假设两组有相同的方差，当假设成立时，它比Welch’s检验更强，主要用于样本含量较小（例如n<30），总体标准差σ未知的正态分布。
Welch’s t-test	t-test的一种变形，用于当两组无法满足方差相同的假设时使用。
White’s无参t-test	无参数的检验，由White为临床宏基因组数据分析提出。此方法使用排序过程移除标准t-test的正态假设。此外，它使用启法式鉴定松散的特征，可采用Fisher精确检验和pooling的策略，适合组样本一致，或小于8个样品。大数据集计算耗时。

置信区间

方法	描述
DP: t-test inverted	只有当方差相等的t检验可用。
Scheffe	考虑所有可能的比较，而Tukey-Kramer只考虑成对均值。此种方法较保守
DP: Welch’s inverted	为Welch’s t检验提供置信区间。
DP: bootstrap	适合White’s 无参t-test

多种检验校正

方法	描述
Benjamini-Hochberg FDR	控制假阳性率FDR
Bonferroni	控制整体错误率的经典方法，被批评太保守
Sidak	在整体错误率控制中使用不多，但均匀分布数据上比Bonferroni更强，但需要假设个体检验是独立的
Storey’s FDR	控制FDR的新方法，比BH更强。需要估计一些参数和更多的计算资源。

表2：STAMP提供的对于两组样本的假设检验、置信区间与多重校正方法。其中加粗为推荐方法，翻译自STAMP 2.1.3帮助文档第17页。

统计假设

方法	描述
Bootstrap	一种无参方法，与Barnard精确检验相似，假设放回抽样
卡方Chi-squre	大样本与Fisher精确检验类似，但更自由
Yates卡方	在卡方基础上考虑了分布，比Fisher更保守
Fisher精确检验	条件精确检验，P值采用最大似然方法。宏基因组大数据样本计算速度快，应用广泛且公众认可
G-test	大样本与Fisher近似，比卡方更合适，比Fisher更灵活
G-test with Yates’	大样本与Fisher类似，考虑自然离散校正，比Fisher更保守
G-test(w/Yates’)+Fisher’s	当列联表中小于20使用Fisher精确检验，其它使用G-test。为了结果清楚，我们推荐只使用Fisher精确检验。而在探索数据阶段，使用混合的统计方法可能更有效
超几何分布	P值使用两种方法的条件精确检验。比最小似然法(在R和StatXact中常用)更快。但更保守。
置换	与Fisher类似，假定无放回抽样

置信区间

方法	描述
DP: 渐近	标准的大样本方法
Scheffe	考虑所有可能的比较，而Tukey-Kramer只考虑成对均值。此种方法较保守
DP: CC渐近	考虑自然离散分布和连续校正
DP: Newcombe-Wilson	Newcombe推荐的7种渐近方法中最优的
OR: Haldane adjustmet	大样本方法结合校正解决退化问题
RP: 渐近	标准的大样本方法

多重检验校正

方法	描述
Benjamini-Hochberg FDR	控制假阳性率FDR
Bonferroni	控制整体错误率的经典方法，被批评太保守
Sidak	在整体错误率控制中使用不多，但均匀分布数据上比Bonferroni更强，但需要假设个体检验是独立的
Storey’s FDR	控制FDR的新方法，比BH更强。需要估计一些参数和更多的计算资源。