FACS:评价样本固定和样品细胞通透不充分的指标

一般来说,当流式细胞仪检测到的信号暗淡/微弱或大部分停留在阴性对照(无荧光信号)时,说明样品固定和/或通透性不足。具体来说,如果您要寻找的细胞内蛋白质的表达水平是一个变量,您应该能看到一个明显的阳性峰/信号,并与阴性对照分开。如果您感兴趣的蛋白质的存在是一个变量,那么您需要在固定/透化过程中提供一个阳性对照,看看您的样本中表达的信号程度是否与阳性对照一致。但要注意的是,流式细胞仪显示微弱或无信号也可能是由于:(1)固定剂选择不当,影响了抗原的检测;(2)弱表达的靶标与微弱的荧光团配对不当;或(3)诱导信号的处理不够充分。由于固定渗透不充分,光散点图/显示可能会显示出改变的轮廓。

如果在采集前将样本保存在冰箱中,不适当的固定可能会导致样本降解。不理想的通透性会导致双相染色,通透的细胞染色程度高,而未通透的细胞染色程度低或为阴性。

有时你会看到较大的 FSC 的 “阴影 “或重复群体,尤其是在 LWB 中。有时还会看到 IC 标记的 “涂片”,表明染色不完全。其他指标:细胞形态变化、信号消失。固定液(甲醛)必须不含甲醇,以防止细胞渗透,然后才能在细胞固定过程中实现适当的交联。

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