RNA抽提一般方法和流程

RNA抽提一般方法和流程

1.TRIzol®或类似产品中的组织或细胞裂解比例:

  • 组织:每100毫克组织使用1毫升TRIzol。
  • 培养细胞:每1 X 107细胞使用1毫升TRIzol。

2.室温下静置5分钟,以促进核糖体蛋白复合物解离。

3.每使用1毫升TRIzol®裂解试剂,添加0.2毫升氯仿/异戊醇(49:1)。用手使劲摇晃10秒。

4.冰上孵出样品2-3分钟,在4°C下离心15分钟,将RNA从组织/细胞裂解液中分离出来。

5.使用移液器将顶部的水相转移到新的无RNA酶管中。

6.沉淀样品:可以在此步骤中使用异丙醇或氯化锂。

异丙醇:在提取的水层中添加1mL异丙醇。在-20°C孵育1小时。

氯化锂:氯化锂选择性沉淀RNA而不是DNA或蛋白质。加入正确量的7.5MLiCl溶液,使提取水层中的LiCl浓度达到2.5M。在-20°C孵育1小时。

如果RNA产量很小,可以加入使用无RNA酶的糖原作为载体,以促进RNA沉淀。

7.在4°C,10,000xg,离心20分钟,丢弃上层。管底应该有一个凝胶状的白色颗粒,为总RNA。

8.将颗粒悬浮在0.5-1毫升的75%乙醇和漩涡中几秒钟来清洗RNA。在4°C下离心5分钟,10,000xg,并去除上清液。

9.在不干扰RNA颗粒的情况下,尽可能多地去除乙醇洗剂。空气干燥5-10分钟。注意:在溶解之前,不要让颗粒太干燥很重要,这会影响RNA的溶解度。

10.在无RNA酶水或TE中悬浮RNA颗粒。使用分光光度计(如纳米滴管)、琼脂糖凝胶或生物分析仪定量和评估RNA样本的质量。