RNA-蛋白互作:Pull-Down实验

概述:

此方法是利用脱硫生物素末端标记的 RNA 和链霉亲和素磁珠标记的来高效富集RNA 结合蛋白(RBP)。RNA-蛋白Pull-Down的原理是将RNA与链霉亲和素磁珠结合。之后在蛋白质-RNA结合缓冲液中平衡RNA结合的磁珠,再加入蛋白裂解液。随后添加适当的缓冲液、涡旋振荡,并在磁力架上分离,洗涤磁珠。最后样品可通过非变性的生物素洗脱缓冲液或SDS- PAGE上样缓冲液洗脱,用于下游分析。

目的:

寻找与RNA相互作用的蛋白质

步骤:

(1) RNA 结合到链霉亲和素磁珠

1) 加入 50 μl 链霉亲和素磁珠到 1.5ml 的 EP 管,将 EP 管放入磁力架,吸去液体;

2) 加入 50 μl pH7.5 20mM Tris重悬磁珠;

3) 重复步骤 1,2;

4) 将 EP 管放入磁力架,吸去液体;

5) 加入 50 μl 1×RNA Capture Buffer 重悬磁珠;

6) 加入 50 pmol RNA探针到磁珠中,混匀;

7) 室温孵育 30min;

(2) 蛋白结合到 RNA

1) 加入 50 μl 链霉亲和素磁珠到 1.5ml 的 EP 管,将 EP 管放入磁力架,吸去液体;

2) 加入 50 μl pH7.5 20mM Tris 重悬磁珠;

3) 重复步骤 1,2;

4) 将 EP 管放入磁力架,吸去液体;

5) 加入 100 μl1×Protein-RNA Binding Buffer 到磁珠,混匀;

6)准备 Protein-RNA Binding Reaction Master Mix;

7) 将 EP 管放入磁力架,吸去液体。加入 100 μl Master Mix,混匀;

8) 4℃孵育 60min;

(3) 洗脱 RNA-Binding protein

1) 将 EP 管放入磁力架,吸去液体;

2) 加入 100 μl 1×wash buffer,混匀,将 EP 管放入磁力架,吸去液体;

3) 重复步骤 1,2;

4) 加入 50 μl Elution buffer,混匀,37℃孵育 30min;

5) 将 EP 管放入磁力架,收集液体,-20℃保存。

(4) Western-blot或质谱分析。

流程图:

RNA-蛋白互作:Pull-Down实验

如若转载,请注明出处:https://www.ouq.net/rna-%e8%9b%8b%e7%99%bd%e4%ba%92%e4%bd%9c%ef%bc%9apull-down%e5%ae%9e%e9%aa%8c.html

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