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Real time实时定量PCR实验原理和方法

概述:

Real-Time PCR 技术,又称实时定量荧光PCR(real-time quantitative PCR),是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量。

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。Real-Time PCR作为一个极有效的实验方法,已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。常用方法:SYBR green(荧光染料掺入法) 和Taqman probe (探针法)。

目的:

用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析。

原理:

1.SYBR green(非特异性荧光标记):

在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

2.Taqman Probe(特异性荧光标记):

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

步骤:

  1. RNA抽提(以细胞样品为例,操作步骤同RT-PCR)

1.1弃去培液,PBS洗2遍,加入1ml Trizol,轻轻吹打,直至细胞脱落,吸入1.5 ml EP管内,静置5 min。(Trizol量根据细胞密度可适当调整,建议:6孔板细胞长满~1ml Trizol)

1.2 加入200μl氯仿(三氯甲烷),用手剧烈震荡15秒,室温静置2-3分钟。(氯仿量为1/5 Trizol)

1.3 12000g,4℃,离心15min。

1.4 仔细转移上层水相到1个新EP管中,不能贪多,约400-500μl。

1.5加等体积异丙醇,轻柔混合4~5次,室温放置10分钟。

1.6 12000g,4℃,离心10min。

1.7轻轻倒去上清,用20 μl枪轻轻吸去残液,沉淀用1ml 75%乙醇(0.75ml无水乙醇+0.25ml DEPC水,现配)洗1~2次,涡旋混匀。

1.8吸去上清,5-10分钟空气干燥RNA。(肉眼不能明显看到水分即可)

1.9加15-20μl DEPC水,吹打数次,测浓度。

注释:mRNA不稳定,很容易讲解,因此mRNA提取过程中要尽量避免RNA酶污染。

  1. 反转录(参照商品化试剂盒说明书)
  2. 定量PCR实验(具体参数设置请参照商品化试剂盒说明书)

(1)PCR reaction mix的制备 (在冰上操作);

(2)将8联管进行短暂离心,确保所有反应液在反应孔底部;

(3)PCR 反应,采用了标准的三步法程序进行反应

(4)在PCR 反应后,进行熔解曲线分析

  1. 定量PCR数据分析

(1)定量PCR 试验原始数据

(2)内参基因在不同样本中的数据分析

(3)目的基因表达量分析

(4)表达差异的计算

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