RACE技术原理和方法

RACE技术

概述:

近年来随着生物技术的不断发展,出现了许多克隆新基因的方法和手段,cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5’和3’末端的有效方法,以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。

RACE技术原理和方法

目的:

1.可用于cDNA文库的构建及筛选。

2.应用RACE克隆已知片段的旁侧内部序列。

3.RACE可用于克隆同源基因的同源片段,为寻找同源基因提供了一种手段。

4.RACE技术与生物信息学,例如EST库相结合,具有快速,高效克隆新基因的特点。

 

原理:

RACE是采用PCR技术由已知的部分cDNA顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 包括单边PCR和锚定PCR。

 

操作步骤:

1、3’RACE-PCR

3’-RACE的步骤是:利用mRNA的3’末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点,以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer, GSP)作为上游引物,用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer ,UPM)作为下游引物,以cDNA第一链为模板,进行PCR循环,把目的基因3’末端的DNA片段扩增出来。

RACE技术原理和方法

2、5’RACE-PCR

5‘-RACE的步骤是先利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点,以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下,反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性,在反转录达到第一链的5‘末端时自动加上3-5个(dC)残基,退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后,转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer, UPM)作为上游引物,用一个基因特异引物2(GSP 2 gene specific primer, GSP)作为下游引物,以SMART第一链cDNA为模板,进行PCR循环,把目的基因5‘末端的cDNA片段扩增出来。最终,从2个有相互重叠序列的3′ / 5‘-RACE产物中获得全长cDNA,或者通过分析RACE产物的3‘和5‘端序列,合成相应引物扩增出全长cDNA。

RACE技术原理和方法

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