实验方法总结（1）：基因操作工具

1、基因A（GeneA）的敲减载体构建

版本1：针对GeneA，在Sigma网站上搜索已验证过敲减效率的shRNA序列，合成后两端加上酶切位点，合成双链DNA oligo，成为含干扰序列的具对应粘性末端的shRNA表达框架。以EcorI和BamHI内切酶酶切pEGFP载体以使其线性化，形成不对称的粘性末端。将shRNA表达框架插入pGP，转化大肠杆菌感受态细胞，阳性克隆行PCR鉴定与测序，构建含有针对GeneA的shRNA骨架质粒。

版本2：从Genebank调取人GeneA核苷酸序列，利用Ambion数据库软件设计针对GeneA的有效的shRNA序列，经Blast 比对进行同源性分析后，选出特异性较高的3 组分别命名，以可以被任意替换的茎干发夹结构作为阴性对照。取pEGFP shRNA载体15μL 于EP 管， 用BamHI 1.5μL 与EcoRII 1.5μL、10×buffer 5μL 酶切反应4 h 以上；产物回收加入T4 DNA Ligase 使GeneA shRNA 片段与目的载体连接，连接产物加入至DH5α感受态细胞中转化；用高纯质粒小量提取试剂盒进行质粒提取，同时挑取阳性克隆行PCR 鉴定、DNA 测序。

2、GeneA过表达载体构建

从Pubmed Nucleotide数据库中检索针对目的基因的CDS序列，将序列导入DNAMAN软件中，进行酶切位点分析；在该序列中不包含的酶切位点中，选择克隆载体上多克隆位点中有的两个限制性内切酶——EcoRI和SacII。引物直接在GeneA CDS编码区起始和末端设计，然后在引物的5’端加上相应的酶切位点。以cDNA为模板扩增目的基因片段，电泳胶回收目的片段后用其两端酶切位点处理片段并纯化回收。以同样的酶切位点处理pCDH载体以使其线性化，胶回收载体后与片段连接并转化DH5α感受态细胞，通过PCR鉴定阳性克隆并测序。

3、GeneA点突变载体构建

版本1：根据突变位点特异性设计突变寡核苷酸引物并合成含突变位点且互补的两条引物。在PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase 聚合酶的作用下，合成整个含有突变位点的质粒。在反应液中加入Dpn I 显著性内切酶，37℃ 1 h。Dpn I 只能切断腺嘌呤甲基化的DNA， 能将含有甲基化的原始模板消化，留下没有甲基修饰的突变质粒。将反应液转化入感受态大肠杆菌。PCR 所得的突变质粒的缺口能在大肠杆菌中得到修复，所获得的菌落即含有突变质粒。

版本2：使用Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit定点突变试剂盒构建GeneA点突变载体。针对需引入突变的区域设计含突变位点的引物，将质粒进行反向PCR扩增，扩增产物与DpnI混合，置于37℃恒温反应1～2小时进行消化，去除甲基化模板质粒。配制含有Exnase的单点突变重组反应体系。置于37℃反应 30 min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5 min。取20 μl冷却反应液，加入到200 μl感受态细胞中进行转化，随后取100 μl菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上，长出来的阳性克隆PCR，测序鉴定。

4、GeneA敲除载体构建（CRISPR/Cas9法）

从NCBI数据库中查询GeneA的CDS序列，在外显子中确定待敲除的序列，选择23-250bp的外显子序列输入软件中，进行特异sgRNA设计，根据输出的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos。将合成的Oligos以逐步降温的方法退货成双链，然后与Cas9质粒进行连接，转化DH5α感受态大肠杆菌细胞，涂板，阳性克隆测序，正确的阳性克隆，小抽后获得含shRNA表达元件的Cas9质粒。错配酶法检测剪切活性：靶序列PCR扩增后经变性、退火，将形成错配。错配酶（CEL1或T7E1酶）将识别错配的杂合双链并剪切。产物跑电泳，比较切割条带与未切割条带的比例，判断Cas/sgRNA的活性。

5、GeneA敲除载体构建（TALENs 法）

TAL效应因子（TAL effector, TALE）具有序列特异性结合能力，通过将FokI核酸酶与一段人造TALE连接起来，形成了一类具有特异性基因组编辑功能的强大工具，即TALEN。利用 TALEN 技术实现基因组定点修饰的流程包括以下几个步骤。第一步，从选定的目标序列中寻找合适的 TALE 候选靶位点，选择的 DNA 序列 5′ 端第一个碱基最好为 T。为了能快速获得合适的 TALE 候选靶位点，目前已经建立了多个在线软件：(1) https://boglab.plp.iastate.edu；(2)http://idtale.kaust.edu.sa；(3) http://zifit.partners.org/ZiFiT ;（4）http://bloglabx.plp.iastae.edu/TALENT/help.php。

第二步， 获取针对 靶 序 列 的 特 异TALE 蛋白。这一步是 TALEN 技术最为重要和复杂的一步，目前已经有多篇文章报道了改进后的获取 TALEN 的方法 [18-22]。第三步，选择合适的 FokI结构域，利用分子生物学的方法把 TALE 和 FokI组装在一起构建完整的 TALEN 蛋白。第四步，将完整的 TALEN 引入细胞进行基因组定点修饰操作。第五步，筛选阳性克隆，评价效果。以上并不是每个 TALEN 必经的步骤，有的会在第三步与第四步之间加入酵母双杂交等评估，首先确定其活性，然后再用于实验。

实验方法：

根 据TALEN 靶点选择的原则和文献的报道，针对 GeneA的第一外显子设计了一对靶点。先要分别构建出识别左、右半位点的 TALE重复序列载体，再与 pCS2 载体连接，形成最终的表达载体。将 TALE基本单元模块载体质粒转化至感受态细胞 TOP 菌种中;大量摇活含有质粒的大肠杆菌后，采用天根的质粒小提试剂盒提取质粒;将质粒经酶切后( SpeI、Nhe I、Hind III)进行回收、转化、连接反应，通过菌液 PCＲ 筛选出连接成功的质粒后，进入下一轮反应;经过几轮酶切、切胶回收及连接反应，直至完成所需要的两侧半位点的 TALE 重复序列，其中每轮的连接后都需要进行测序确认;再将 TALE 重复序列与 pCS2 载体连接，构建出最终的 pCS2-TALEN 表达载体质粒，酶切检测片段连接情况后，采用 SP6 测序确认。

6、GeneA的miRNA载体表达构建

从 GenBank数据库上搜索获得 GeneA基因的mRNA序列。从 网站 www．invitrogen.com/mai获取工具用来设计 miRNA。选择 GeneA基 因 mRNA序列中21nt片段为合适miRNA靶序列。结合线性化pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR真核表达载体(Invitrogen公司)的特点，设计4个64nt的pre-miRNA寡核苷酸序列，该序列针对 GeneA基因不同区域，并且得到寡核苷酸序列互补的序列，经NCBI Blast的相似性搜索，排除其非特异同源性部分。其结构为 5’-TGC TG overhang + G + antisense target sequence+ miRNA loop + Sense target sequence-3’。将4对合成好的oligo进行退火。将退火的4条双链oligo用T4DNA连接酶与酶切后的线性载体连接。取连接反应物转化 DH5α菌株，挑选阳性克隆质粒，PCR鉴定与培养。利用小量提取试剂盒小提质粒，经 PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，取阳性克隆菌液送公司测序鉴定。