CRISPR敲入同源臂的理想长度是多少?

基因敲除物(<2 kb)的同源臂的理想长度是多少?长的基因敲除物(>5 kb)的同源臂的理想长度是多少?

在果蝇中,长度为0.5-2 kb的同源臂可以很容易地用于敲除。在蚊子中,0.5-1 kb的同源臂适用于敲除<2 kb的供体质粒。如果供体质粒超过5 kb,>1 kb的同源臂更合适。例如,在我们最近的研究中,我们使用的供体质粒大小为2698 bp;其中包含一个Pub启动子、eGFP标记和聚A片段SV40。在埃及伊蚊中GCTL3基因敲除的同源臂的长度为677 bp,L和R臂为586 bp。(Li et al. 2020; Li et al 2021).

KI的同源臂的长度取决于基因组序列的特异性如何。如果序列是特异性的,500-1,000 bp是理想的。如果同源臂中有重复序列,你可能要增加到1.5-2kb。对我们来说,1,000-1,500 bp是理想的长度。对于>5kb,你可以将长度增加到2kb-2.5kb。然而,这取决于制作该同源臂的难度如何。2kb对于大型KI来说应该是可行的。

当我们进行小于2kb的基因敲除时,我们产生的上游和下游同源臂约为400bp。我们确保同源臂的长度至少为200bp,不超过500bp。根据我们的经验,低于200bp,同源重组的效率就会下降。关于同源臂的上限,它们可以被设计成长于500bp;然而,考虑到大多数CRISPR质粒系统的总体尺寸,我们避免添加不必要的序列。我们没有进行过大于5kb的敲除。可以想象,更长的片段需要更长的同源性,这一点可以尝试一下。在这种情况下,可能最好使用两个质粒以保持质粒的大小可控。

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