了解组织修复中的巨噬细胞异质性是一个重大挑战。在这里，我们描述了一个协议，它结合了从皮肤伤口中分离免疫细胞和随后基于流式细胞仪的伤口巨噬细胞分拣和单细胞RNA测序。我们使用原始Smart-seq2协议的修改版来提高速度和准确性。该协议对于分析伤口巨噬细胞激活表型的明显异质性很有用，并可能适用于其他皮肤炎症的实验模型。
本方案旨在使用Smart-seq2工作流程从小鼠皮肤伤口中分离出巨噬细胞用于scRNA-seq。根据受伤后的时间点，大约50,000（受伤后第14天）-200,000（受伤后第4天）CD45+CD11b+F4/80+伤口巨噬细胞可以从一只小鼠的4个伤口获得。通过DAPI染色和FACS分析，细胞存活率约为75-85%（图2A和2B）。FACS分析对表面标记物（如CD301b、Trem2、MHC II）产生高度可重复的结果，可用于区分巨噬细胞亚群，并可与RNA测序后的基因表达数据相结合。
Smart-seq2方法，加上对皮肤伤口的仔细解剖和随后对巨噬细胞的FACS排序，使得在愈合反应的时间过程中对巨噬细胞异质性的排序和研究具有很大的特异性。这种特异性的代价是可以处理的细胞数量有限，在实验能力和时间方面都是如此。这与其他基于微流控技术的单细胞测序方法形成鲜明对比，后者允许更高的捕获和测序吞吐量，可达数千个细胞。然而，与高通量单细胞方法相比，用Smart-seq2工作流程实现的基因检测灵敏度通常更高，主要是因为每个实验的细胞数量较少，可以对每个细胞进行更深入的测序，同时将测序成本控制在一个合理的水平。
Smart-seq2协议旨在扩增和测序完整的转录本，不像其他方法只捕获mRNA的3′或5′末端。这是有优势的，不仅因为它可以检测更多的基因，而且还可以进行下游的定量和定性分析，更深入地了解细胞内和细胞间的表达异质性。scRNA-seq分析的细节可以在我们最近的出版物中找到（Willenborg等人，2021）。
原文：https://star-protocols.cell.com/protocols/1595
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