荧光原位杂交技术(FISH)原理及实验操作步骤

1974年Evans首次将染色体显带技术和染色体原位杂交联合应用,提高了定位的准确性。20世纪70年代后期人们开始探讨荧光标记的原位杂交,即FISH技术。1981年Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上,标志着染色体定位技术取得了重要进展。20世纪90年代,随着人类基因组计划的进行,由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要,FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。

1.原理

FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的,二者经变性-退火-复性,即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛,可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应,经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

2.实验流程

FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。

3.特点

原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高,可以通过延长曝光时间加强信号强度,故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足,这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系,具有以下优点:1、荧光试剂和探针经济、安全;2、探针稳定,一次标记后可在两年内使用;3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确;4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列,其灵敏度与放射性探针相当;5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列;6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化,也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。

缺点:不能达到100%杂交,特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。

4.应用

该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位,而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。

荧光原位杂交FISH操作规程

一、主要试剂

1变性液 20SSC 4mlddH2O 8ml甲酰胺28ml

2PBD液 1000ml 20SSC中加入1.25gTween20 二、操作流程

1 硅化玻片切片烤片60过夜

2 脱蜡入水斜置切片空干

3 2SSC洗涤三次每次5min下简写为35

4 0.2M HCl处理室温10接步骤3

5 0.25mg/ml 蛋白酶K处理室温1530接步骤3

6 切片入20梯度酒精脱水各2空干

7 切片入85变性液8

8 迅速入20梯度酒精脱水各2空干

9 杂交液85变性50冰浴10滴加至切片加盖玻片37过夜

10 反应体系中加入等体积的甲酰胺4510

11 2SSC洗涤405min2SSC洗涤375min

12 PBD洗涤切片32

13 滴加异硫氢酸荧光素标记的亲和素AvidinFITC,塑膜封片3730min

14 洗涤同步骤12

15 滴加抗亲和素AntiAvidin, 3730min

16) 重复步骤121312

17 滴加DAP/I(二脒基二苯基吲哚/碘化丙啶)直接封片荧光镜检 上

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