数字PCR digital PCR

概述:

Digital PCR(dPCR)即数字PCR,它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR,数字PCR可以直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量。

数字PCR是最新的定量技术,基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量,是一种绝对定量的方法。由于数字PCR能够直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量,因此特别适用于依靠Real-time PCR的Ct值不能很好分辨的应用领域,例如:拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。

目的:

对DNA分子的个数进行绝对定量。

原理:

其主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法,将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中,每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后,有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号,没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积,就可以推算出原始溶液的核酸浓度。

步骤:

1.分离并纯化基因组DNA;

2.计划数字PCR实验,确定样品的最佳稀释度,以获得数字PCR答案;

3.上样,将DNA样品与TaqMan Assay以及OpenArray数字PCR预混液上样到OpenArray 384孔板;

4.循环和成像,利用OpenArray AccuFill 系统将反应上样到OpenArray平板。将OpenArray平板插入OpenArray箱中,装满浸液,并用封箱胶水密封。利用OpenArray® 实时定量PCR系统开展读取。

5.快速轻松地获取和分析数据。

流程图:

数字PCR digital PCR

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