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实验方法总结(2):细胞生物学部分

1.    原代细胞分离与培养

1.1原代细胞分离

人或动物体内(或胚胎组织)由于多种细胞结合紧密,不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖,必须将现有的组织块充分散开,使细胞解离出来。

  • 悬浮细胞的分离方法

组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料,最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10 min。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层,这样可根据需要收获目的细胞。

  • 实体组织材料的分离方法

对于实体组织材料,由于细胞间结合紧密,为了使组织中的细胞充分分散,形成细胞悬液,可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。其中,机械分散法的特点是简便、快速,但对组织机械损伤大,而且细胞分散效果差,适用于处理纤维成分少的软组织。而消化分离法是指把组织剪切成较小团块(或糊状),应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动,使团块膨松,由块状变成絮状,此时再采用机械法,用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡,使细胞团块得以较充分的分散,制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液,接种培养后,细胞容易贴壁生长。

 

1.2原代细胞培养

原代细胞的培养也叫初代培养,是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养,是建立细胞系的第一步。

  • 组织块培养法

组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法。其基本方法是将剪成的小组织团块接种于培养瓶(或皿)中,瓶壁可预先涂以胶原薄层,以利于组织块粘着于瓶壁,使周边细胞能沿瓶壁向外生长

  • 消化培养法
  • 悬浮细胞培养法。

对于悬浮生长的细胞,如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化,可采用低速离心分离,直接培养,或经淋巴细胞分层液分离后接种培养

  • 器官培养。

器官培养是指从供体取得器官或组织块后,不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养。器官培养可保持器官组织的相对完整性,可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响,以及局部环境的生物调节作用。

2. 干细胞分离培养

2.1胚胎干细胞诱导分化

首先将类胚体消化成单细胞,贴壁培养,于不同的培养阶段添加不同种类和不同浓度的化学物质、条件培养基或细胞因子等诱导条件,直接促进ES细胞定向分化为某种特殊类型的细胞;或通过改变培养条件对某些类型的细胞分化起抑制作用,从而高效诱导目的细胞的分化。改变细胞的培养条件使ES细胞进行定向分化的基本策略有三种:一是向培养基中添加生长因子和化学诱导剂等;二是将ES细胞与其它细胞一起进行培养;三是将细胞接种在适当的底物上,以促使细胞中某些特定基因的表达上调或下降,从而引发细胞沿着某一特定谱系进行分化。

体外诱导胚胎干细胞的物质有化学试剂诱导法、细胞因子诱导法和外源基因诱导法

化学试剂诱导法:维甲酸(RA)、DMSO、β-磷酸甘油、维生素C(VC)、地塞米松、维生素K3(VK3)以及2,5-羟基维生素D3等化学试剂,都能诱导ES细胞定向分化为特定类型细胞。

细胞因子诱导法:ES细胞在培养过程中对许多细胞因子具有很强的依赖性。增加或减少一种或几种细胞因子可影响ES细胞的增殖或分化。目前研究最深入的细胞因子主要有骨形成蛋白(BMPs)和成纤维细胞生长因子(FGF)等。

外源基因诱导法:转基因法可以弥补细胞因子法的不足。其原理是使某个促分化基因在ES细胞中过度表达,从而调控ES细胞的分化。应用此方法之前,首先要确定决定该细胞向不同方向分化的关键基因,其次还要确保在适宜的时间将此基因正确插入到ES细胞基因组序列上。

2.2肿瘤干细胞(CSC)分离鉴定

对于CSC的分离纯化主要有根据细胞表型特征和生物学特性而建立的两大类方法 :

第一类:依赖于细胞表面标志的分离方法

造血系统肿瘤干细胞:正常造血干细胞的表型为CD34+CD38+Thy-1

实体瘤肿瘤干细胞:

  1. 乳腺癌:ESA+CD44+CD24/LowLineage的细胞是乳腺癌CSC。
  2. 脑肿瘤:将CD133+的肿瘤细胞命名为脑肿瘤干细胞(BTSC), 还表达Sox2、Musashi-1、bmi-1、磷酸丝氨酸磷酸化酶等神经干细胞和其它干细胞的基因特征
  3. 结直肠癌:CD133+细胞是结直肠癌细胞的起始细胞。上皮细胞黏附分子、CD44、CD166可以作为鉴定结直肠癌干细胞的细胞表面标志。

以乳腺癌为例,介绍实验方法(其他肿瘤针对下面蓝色的关键词更改):

乳腺肿瘤细胞分离培养:选择XXX医院肿瘤外科接受治疗的乳腺癌患者,经过患者及其家属知情同意,在手术室无菌条件下获取肿瘤组织样本约10g,置无菌组织转移液中,迅速转入无菌实验室内,PBS漂洗数遍,去除脂肪及坏死部分,将乳腺组织充分剪碎;将上述乳腺肿瘤组织移入离心管,加入8mL组织消化液(含2700U/mLⅣ型胶原酶1mL、0.02mg/mL透明质酸酶100μL、DNase50μL的DMEM培养液),轻轻混匀,37℃水浴消化1~2小时,期间每20~30min振摇离心管1次,以便充分消化;消化结束后,加入10mL PBS,摇匀后以1000r/min离心4min,弃上清,加入1mL乳腺肿瘤干细胞培养液(含10mL/L FBS,100U/mL青霉素,100mg/mL链霉素,10ng/mL bFGF,20ng/mL EGF,20ng/mL ITS的DMEM-F12培养液),混匀,1000r/min离心4min,弃上清;以1×106/mL细胞密度接种于细胞培养瓶中,置入37℃、50mL/L CO2培养箱中培养。3d后换液,约7~10d开始出现悬浮生长的细胞克隆球。

流式细胞术检测获得乳腺肿瘤细胞:收集培养的乳腺肿瘤细胞克隆球,离心并弃去培养基;PBS漂洗1遍,Accutase消化2min后加等体积培养基终止消化;将细胞悬液移入15mL离心管1000r/min离心4min,弃上清,用PBS溶液混悬后无菌滤膜过滤,取4支试管,按如下组合顺序分别加入荧光标记抗体各10μL:IgG1-PE/IgG2-FITC,CD44-FITC/IgG1-PE,CD24-PE/IgG2-FITC,CD44-FITC/CD24-PE,再加入500μL细胞悬液入试管中,混匀,室温避光静置15min,流式细胞仪检测。

 

第二类 根据干细胞外排DNA结合荧光染料Hoechst33342而建立的SP细胞分离法

在Hoechst33342染色的骨髓细胞中存在着一群染色很浅的细胞群,通过紫外激发后 用双波长分别为450nm的蓝色荧光~675nm的红色荧光分析,其中有不到0.1%的细胞发 出微弱的蓝光和红光,在流式二维分析点阵图上,呈彗星状分布在造血干/祖细胞主群的一侧 ,因此被称为侧群(SP)细胞。SP细胞广泛存在于人和动物 的多种成体组织 、实体瘤及肿瘤细胞系中,并具有干细胞样特征。

实验方法:

  • 细胞染色: 细胞消化计数,用37℃预热的DF12培养基重悬,调整到1×106/mL浓度,制备成单细胞悬液;加入荧光染料Hoechst33342,使终浓度为6 μg/mL,37℃避光水浴90 min;冰上10 min终止染色,计数细胞;离心细胞后,用冰预冷DF12洗涤细胞并重悬浮,将分选组调整浓度到1×107/mL以上,必要时加入1倍的DNase I;上机前再加入PI使终浓度为2 μg/mL以区分死细胞,并且400滤网过滤细胞。② 流式细胞仪检测:355 nm UV激发光源,610 nm双色短通反射滤镜,450 nm和675 nm边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分,线性模式采集信号. 测量前向散射和侧向散射二维参数图,检测细胞均一性,以Hoechst Red为X轴,Hoechst Blue为Y轴作二维散点图,将低Hoechst Red及低Hoechst Blue且维拉帕米组缺失的区域设定为SP细胞的“门”(gate),计算百分比,分选出SP细胞及Non SP细胞。

3. 细胞增殖相关研究方法

3.1 MTT分析法

MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂,生成蓝色的formazan结晶,formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失,不能将MTT还原)。

实验方法:

接种XXX细胞用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200 μL。培养细胞同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。呈色培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5 mg/mL用PBS配)20 μL。继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150 μL DMSO,振荡10 min,使结晶物充分融解。比色选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

3.2 XTT

XTT是一种与MTT类似的四唑氮衍生物,可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色甲肷产物,当XTT与电子偶合剂共同使用时,甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。

实验方法:

首先配置6.6 mmol/L XTT溶液和220 mmol/L吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)溶液。临用时将XTT与PMS按1:1混合,形成XTT/PMS。接种XXX细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200 μL。培养细胞:同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。于终止培养前2 h,每孔加入XTT/PMS 20μL,混匀后再培养2 h。在酶标仪上450 nm处测定光吸光度,参考波长为655nm。

3.3 WST-1

此法是用于测定细胞增殖或毒性试验中活细胞数目的一种高灵敏度、高稳定性且无放射性的比色检测法。实验的灵敏度比其它四唑盐如MTT,XTT,MTS高,线性范围更宽。

实验方法:

在96孔板加入XXX细胞100 μL/孔(约1×104),置37℃ 5% CO2细胞培养箱培养24小时。加入适当浓度的受试化合物。将96孔板在37℃,含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。采用WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒,向各孔中加入10 μL的四唑盐工作液。37℃下孵育1~4小时。酶标仪在450nm波长处检测每孔的光密度。

3.4 CCK-8(WST-8)

CCK-8是近年新开发的一种更新的水溶性四唑盐检测,原理与WST-1类似:在电子载体1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯盐(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原成具有高度水溶性的橙黄色甲臜产物(Formazan)。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比,用酶联免疫分析仪测定其光吸收值可间接反映活细胞数量,在一定细胞数量范围内甲臜形成的量与细胞数成正比。

实验方法:

在96孔板中接种细胞悬液(100 μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养(37℃,5% CO2)。细胞经处理后。向每孔加入10 μL CCK溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。将培养板在培养箱内孵育1~4小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCl溶液或者1%w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。

3.4 平板克隆形成

平板克隆形成试验方法简单,适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大。

实验方法:

取对数生长期的单层培养的XXX细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,把细胞悬浮在10%胎牛血清的RPMI1640培养液中备用。将细胞悬液作梯度倍数稀释,以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中。一般分每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。置37℃ 5%CO2及饱和湿度的环境下,静置培养2~3周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL,固定15min。然后去固定液,加适量Giemsa应用染色液染10~30min,然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥。将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜(低倍镜)计数大于50个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。

3.5 软琼脂克隆形成

软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时,琼脂温度不宜超过40℃。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个,一般6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖,不适用于软琼脂克隆形成试验。

实验方法:

取对数生长期XXX细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打,使之成为单细胞,作活细胞计数,用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液,高压灭菌后,维持在40℃中不会凝固。按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后,取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7~10mL),冷却凝固,可作底层琼脂置CO2温箱中备用。按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后,再向管中加入0.2mL的细胞悬液,充分混匀,注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中,逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后,置入37℃5%CO2温箱中培养10~14天。把平皿放置在倒置显微镜下,观察细胞克隆数。计算形成率。

3.6 BrdU

BrdU是胸腺嘧啶的衍生物,常用于标记活细胞中新合成的DNA,可代替胸腺嘧啶选择性整合到复制细胞中新合成的DNA中(细胞周期S期)。这种掺入可以稳定存在,随着DNA复制进入子细胞中。BrdU特异性抗体可以用于检测BrdU的掺入,从而判断细胞的增殖能力。

实验方法:

将细胞密度为1.5×105/mL的XXX细胞接种于直径35 mm培养皿中(内放置一盖玻片),培养1天,用含0.4%FBS培养液同步化3天,使绝大多数细胞处于G0期。加入BrdU(储液:1.0mg/mL,终浓度为0.03μg/mL),37℃,孵育40min。弃培养液,玻片用PBS洗涤3次。甲醇/醋酸固定10min。经固定的玻片空气干燥,0.3%H2O2-甲醇30min灭活内源性氧化酶。5%正常兔血清封闭。甲酰胺100℃,5min变性核酸。冰浴冷却后PBS洗涤,加1抗即抗小鼠BrdU单抗(工作浓度1:50),阴性对照加PBS或血清。按免疫组织化学常用的检测方法ABC法进行检测,苏木素或伊红衬染,在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数,计算标记指数LI。

4.    细胞转移相关研究方法

4.1 划痕

肿瘤细胞在体外仍具有迁移的能力,本实验借鉴体外细胞致伤愈合实验模型,利用细胞划痕法测定了肿瘤细胞的运动特性。

实验方法:

将细胞密度为5~10×105个/mL的XXX细胞铺于24孔板(每孔500 μL)上,加入含10%胎牛血清的RMPI.1640培养液,培养16~24h,使形成单层细胞。用10μL移液枪枪头(或者无菌牙签)在单层细胞上呈“一”字划痕,用PBS清洗3次,孵育24h后换成含10%胎牛血清的RMPI.1640培养液,孵育24h。观察并拍照:吸去培养液,用PBS清洗3次后,在倒置荧光显微镜下观察并拍照。

4.2 细胞粘附

细胞粘附实验通常分为两类,即细胞与细胞粘附和细胞与基质粘附。机体内许多细胞,如上皮细胞固定在某处发挥功能;另一些细胞,如白细胞,活跃运动,就需要不断调节细胞粘附。细胞粘附性的改变在肿瘤转移过程中也发挥着重要作用。恶性肿瘤具有从原发瘤分离及在体内扩散的能力,提示这些细胞相互识别及粘附机制发生了改变。

实验方法:

用10 μg/mL的纤连蛋白(fibronectin,FN)预铺96孔板,70 μL/孔,4℃过夜后,PBS洗3遍,再用1% BSA于37℃封闭1h,PBS洗3遍。将待测XXX细胞培养至对数生长期,消化细胞,用无血清培养基悬浮细胞,调整浓度为5×105/mL分别接种于预铺FN的96孔板中,每孔5000个细胞,每组设3个复孔。37℃孵育1h后,PBS洗去未黏附的细胞。

检测方法1:

3.5%戊二醛于4℃固定0.5h,PBS洗3遍;0.1%的结晶紫染色,室温静止0.5h,PBS洗3遍,每孔加入100 μL 10%的乙酸,5~10min后用酶标仪检测595nm的吸光度值,用以表示黏附细胞的多少。

检测方法2:按照每孔加入100μL甲醇,固定15 min每孔加入100 μL吉姆萨染液,染色15min,PBS洗去染液倒置显微镜下随机取5个随机视野计数粘附细胞数量病拍照,统计结果。

检测方法3:MTT法或CCK-8检测细胞量。

4.3 Transwell迁移

细胞迁移实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的XXX细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验方法:

所有细胞培养试剂和Transwellchamber放在37℃温育。待测XXX细胞培养至对数生长期,消化细胞,用PBS和无血清培养基先后洗涤一次,用无血清培养基悬浮细胞,计数,调整浓度为2×105/mL。在下室(即24孔板底部)加入600-800μL含10%血清的培养基,上室加入100-150μL细胞悬液,继续在孵箱培养24小时。用镊子小心取出chamber,吸干上室液体,移到预先加入约800μL甲醇的孔中,室温固定30 min。取出chamber,吸干上室固定液,移到预先加入约800μL Giemsa染液的孔中,室温染色15-30 min。轻轻用清水冲洗浸泡数次,取出chamber,吸去上室液体,用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞。用小镊子小心揭下膜,底面朝上晾干,移至载玻片上用中性树胶封片。显微镜下取9个随机视野计数,统计结果。

4.4 Transwell侵袭

所谓Transwell侵袭实验,其实是指将Transwell这一技术应用于肿瘤细胞侵袭研究的一种实验。

实验方法:

基质胶准备:将冻存于-80℃冰箱的BD matrigel 4℃过夜(24h),变成液态。取300μL无血清培养基,加入60μL(或50μg/每室)Matrigel,4℃混匀,加入上室各100μL(3个室),放入37℃培养箱中,孵育4-5h。当出现“白色层”时,说明已经变为固态。消化XXX细胞,无血清培养基洗3次,计数,配成细胞悬液。用无血清培养基洗Matrigel洗1次,每孔加入100μL细胞悬液。下腔室中加入500μL含有20%FBS条件培养基。37℃培养箱中,孵育20-24h。取出transwell用PBS洗2次,5%戊二醛4℃固定。加入0.1%结晶紫染色或Giemsa染色,室温染色5-10min,0.5h,PBS洗2次,用棉球擦去上表面细胞,显微镜下取9个随机视野计数,统计结果。

5. 血管生成

肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程,一般包括包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。由于肿瘤组织这种新生血管结构及功能异常,且血管基质不完善,这种微血管容易发生渗漏,因此肿瘤细胞不需经过复杂的侵袭过程而直接穿透到血管内进入血流并在远隔部位形成转移。

实验方法:

将原浓度的matrigel胶(10mg/mL)置于4℃冰箱中过夜,使其成为胶冻状。将胶冻状的matrigel胶铺入24孔板的孔中,每孔40μL,使其成为一小丘的形状,然后置于37℃孵箱中2h使其固化。将细胞消化计数,将某一密度的XXX细胞悬液滴加至matrigel胶的表面置于37℃孵箱继续培养,每孔1mL,每组三个复孔。于100-400倍相差显微镜下,12,24,48,72,96h后,后取出细胞培养板,拍照,Image-Pro Plus图像分析软件计数每孔的管腔形成个数。

6. 细胞周期:PI染色

荧光染料PI(碘化丙啶)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂,常用于细胞凋亡检测,英文全称是PropidiumIodide。它是一种溴化乙啶的类似物,在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜,但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用,能同时对活细胞和死细胞染色。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和615nm。

实验方法:

取生长期的XXX细胞,加入3mL PBS,去掉液体加入1mL胰蛋白酶消化1~5min。加入5mL PBS制成细胞悬液,移至15mL离心管中1500rpm离心5min,去上清液。加入500μL PBS轻轻吹打细胞团成细胞悬液,在旋涡状态下逐滴加入2 mL 20℃ 95%冷乙醇,混匀后固定30 min。加入5mL PBS,1500 rpm离心5min,去上清液。加入5mL PBS重悬细胞,1500rpm离心5min,去上清液。加入800μL PI染液,用枪轻轻吹打细胞团,混匀,室温避光染色30min。用流式细胞仪上机检测。

7. 细胞凋亡检测

7.1 AnnexinV/PI双染色法

磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。AnnexinV是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将AnnexinV进行荧光素(FITC、PE)或Biotin标记,以标记了的AnnexinV作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将AnnexinV与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

实验方法:

XXX细胞直接收集到10mL的离心管中,每样本细胞数为(1~5)×106/mL, 1000r/min离心5min,弃去培养液。用孵育缓冲液洗涤1次,1000r/min离心5min。用100μL的标记溶液重悬细胞,室温下避光孵育10~15min。1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。加入荧光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min,避光并不时振动。流式细胞仪激发光波长用488nm,用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光,另一波长大于560nm的滤器检测PI。

结果判断:凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性,坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光,而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此,在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,为(FITC-/PI-);右上象限是非活细胞,即坏死细胞,为(FITC+/PI+);而右下象限为凋亡细胞,显现(FITC+/PI-)。

7.2 TUNEL法

TUNEL法也称DNA断裂的原位末端标记法,这一方法能对DNA分子断裂缺口中的3’-OH进行原位标记,借助一种可观测的标记物,如荧光素,能对凋亡细胞的核DNA中产生的3’-OH末端进行原位标记,用荧光显微镜即可进行观察。

实验方法:

固定 → 透膜 → 加TUNEL反应混合物 → 加转化剂-POD → 加底物溶液 → 观察结果

经过实验处理的细胞爬片或者细胞涂片,自然晾干,室温固定15-30 min,PBS洗涤3次,每次5 min,加封闭液,室温孵育10 min。PBS漂洗后加透膜液,室温孵育30min。制备TUNEL反应混合液,处理组用50 μL TdT+450μL荧光素标记的dUTP液混匀;而阴性对照组仅加50μL荧光素标记的dUTP液,阳性对照组先加入100μL DNase1,反应在室温~37℃×10~30min,后面步骤同处理组。玻片干后,加50μL TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50μL荧光素标记的dUTP液)于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×60min。PBS漂洗3次。可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450~500nm,检测波长为515~565nm)。玻片干后加50μl converter-POD于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。PBS漂洗3次。在组织处加50~100μL DAB底物,反应15~25℃×10min。PBS漂洗3次。拍照后再用苏木素或甲基绿复染,几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。加一滴PBS或甘油在视野下,用光学显微镜进行计数(200~500个细胞)并拍照。

7.3 线粒体膜电位(MMP)检测

JC-1是一种碳氰化合物类阳离子荧光染料,可作为检测线粒体跨膜电位指示剂。JC-1在细胞内以聚合体和单体两种不同的物理形式存在,分别处于不同的荧光发射峰。当JC-1浓度低或膜电位水平低时,主要以单体形式存在,激发波长为527nm,呈绿色荧光;当JC-1浓度升高或线粒体膜电位水平较高时,形成聚合物,发出红色的荧光,激发波长为590nm。当细胞发生凋亡时,线粒体跨膜电位被去极化,JC-1从线粒体内释放,红光强度减弱,以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光,根椐这一特征就可以检测线粒体膜电位的变化。

实验方法:

用适当的方法诱导XXX细胞凋亡,收集细胞。用PBS洗涤细胞三次,收集不多于1×106的细胞。取100μL 10×IncubationBuffer加900μL灭菌去离子水稀释成1×IncubationBuffer,混匀并预热至37℃。吸取500μL1×IncubationBuffer,加入1μLJC-1,涡旋混匀配成JC-1工作液。取500μLJC-1工作液将细胞均匀悬浮,37℃,5%CO2的培养箱中孵育15~20min。室温离心(2000rpm,5min)收集细胞,用1×IncubationBuffer洗两次。吸取500μL10×IncubationBuffer重新悬浮细胞。流式细胞仪检测,分析。

8.    细胞分选

8.1 流式分选

流式细胞分选技术是利用流式细胞分选仪,以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒,测量其产生的散射光和发射荧光的强度,从而对细胞(或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术,它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单克隆分选,能复杂样本中的细胞进行鉴定、分类、定量和分离,单次可同时对其中一种到四种特定细胞进行超高速分选纯化、高通量单克隆分选或细胞芯片制备。

实验方法:

分选前先做预实验,优化流式细胞仪的测定条件,建立分选门,具体操作步骤见Cellquest操作步骤说明。根据XXX细胞的含量,调整流速和样品浓度,使XXX细胞通过样品室的浓度为100-300个/秒,最好在200左右。进入CellQuest,从Aquire菜单连机。打开CellQuest中存储的获取窗口,打开优化后存储的仪器设置条件。进样针处放上样本管。从Acquiremenu选择SortSetup。依据样本中XXX细胞的百分比及实验目的决定分选模式:在SortGate中选择分选用的门,如选择NoGate(所有细胞)将只进行获取不分选;在SortCount-中选择0进行连续分选;在SortMode中选择SingleCell、Recovery、Exclusion的某种模式;在AbortedCell中选择不显示排除细胞数。点OK。点击液流控制键RUN。点击获取控制窗口Aquire。分选结束时点击Pause,Abort。取下样本管,换上1mL蒸馏水。点击获取控制窗口Standby。取下收集锥型管。离心浓缩(300g, 5min),用培养液重悬XXX细胞,按实验所需条件进行培养。

 

8.2 磁珠珠分选

免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合,在外加磁场中,通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中,无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性,不在磁场中停留,从而使细胞得以分离。

实验方法:

离心收集待分离XXX细胞,用少量PBE孵育液(0.5%BSA、0.08%EDTAPH7.2PBS,真空抽滤除菌及液体内气体)充分混悬细胞(0.5mL/1×108细胞),加入一抗(10~20μg/mL终浓度),4°C孵育30 min。用20倍体积PBE洗细胞一次,再加PBE(0.3mL/1×108细胞)充分混悬细胞后,加入相应二抗包被的超微磁珠,混匀后置8~15°C孵育10~15 min。将分离柱安装入磁场中,加入0.5mLPBE,在重力作用下自然流尽,以预处理分离柱。将孵育完毕的细胞悬液加到分离柱中,自然流尽。以0.5mL PBE加入分离柱中,自然流尽,洗柱二次。从磁场中取下分离柱,插在试管口上,加入1~2mLPBE,用针芯用力推尽液体,冲出阳性结合的细胞。用培养基洗一次,待用。

9.    细胞转染

细胞转染是指将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术。用于研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中。

实验方法:

转染试剂的准备:将400μL去核酸酶水加入管中,震荡10秒钟,溶解脂状物。震荡后将试剂放在-20℃保存,使用前还需震荡。选择合适的混合比例(1:1-1:2/脂质体体积:DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA,震荡后在加入合适体积的转染试剂,再次震荡。将混合液在室温放置10―15 min。吸去培养板中的培养基,用PBS或者无血清培养基清洗一次。加入混合液,将XXX细胞放回培养箱中培养一个小时。到时后,根据细胞种类决定是否移除混合液,之后加入完全培养基继续培养24-48小时。

10. 细胞慢病毒感染

慢病毒源于反转录病毒,但又有所不同。在感染能力方面比反转录病毒还强,可有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、干细胞等多中类型的细胞,又很少引发基因的免疫反应。

实验方法:

在大规模的感染之前,优化以下参数:细胞种植密度,慢病毒的数量,嘌呤霉素的浓度,感染时间,以确定一个实验的最适条件。在6cm培养皿中种植适当密度的XXX细胞,每孔体积6mL。贴壁细胞:转染前1天种植XXX细胞。悬浮细胞:转染当天种植XXX细胞,培养基中需要含有凝聚胺。XXX细胞中加入病毒:贴壁细胞,弃掉培养基,加入新鲜的含有凝聚胺的培养基。或者,弃掉部分培养基并且补充含有凝聚胺的培养基。调整体积和凝聚胺的浓度,使得凝聚胺的终浓度为8μg/mL。病毒感染:孵育细胞过夜。感染后24h更换培养基。弃掉培养基,换入6mL新鲜的培养基。如果需要抗生素选择,则使用含有抗生素的新鲜培养基。注意:嘌呤霉素的浓度根据每种细胞系来进行优化;常用的浓度范围为2-5μg/mL。孵育细胞,根据需要每隔几天更换培养基(如果需要,则要含有抗生素)。孵育时间的长短主要依赖于感染后的试验。

 

11. 基因稳定细胞株的筛选

外源基因在细胞中的表达可分为两大类,一类是瞬时表达,一类是稳定表达(又叫永久表达)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,虽然可以达到高水平的表达,但通常只持续几天。后者外源DNA整合到宿主细胞染色体上,使宿主细胞可长期表达目的基因。建立稳定细胞株,一般是根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物对靶细胞进行筛选。最常用的抗性标记基因有潮霉素(hygromycin)、新霉素(neomycin)和嘌呤霉素(puromycin)。

实验方法:

G418(Geneticin,遗传霉素)是一种氨基糖苷类抗生素 ,在分子遗传试验中,是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。以G418为例:转染目的基因+neo基因。G418对细胞最小致死量测定:将细胞传至25mL培养瓶中每瓶加3mL细胞生长液待细胞长满,按下列浓度加G418:0、100、200、300、400、500、600、700μg/mL,继续培养观察细胞生长及死亡情况,每天换液一次仍以上述浓度加G418,两周内使细胞全部死亡的最小浓度即为最小致死量。抗性细胞的筛选:将转染的细胞进行传代同时换为选择性培养基(生长培养液+最小致死量浓度G418)继续培养约2周,待对照细胞全部死亡时,已基本得到G418抗性细胞的稳定克隆。挑取单个细胞的克隆至24孔塑料培养板继续进行筛选扩增即为G418抗性细胞。

12. 耐药细胞株的筛选

一种是脂质体转染后,单克隆筛选稳定细胞株。另外一种是应用逆转录病毒,慢病毒转染,筛选稳定细胞株。

脂质体转染:在转染24小时后,消化XXX细胞并计数。将细胞种到96孔板,保证每个孔2-3个细胞,这样才能得到单克隆。待细胞贴壁后,加入抗生素筛选。筛选时间和浓度视细胞而定。一般G418(Geneticin,遗传霉素)作用一个星期,嘌呤霉素作用2-3天。脂质体法筛单克隆时间较长,且效率低,大概只有1%。

慢病毒转染:先要用包装细胞,一般为293细胞,包装出病毒,再用病毒转染目的细胞。包装病毒视不同类型的病毒而定,一般要3-5天的时间。包装好的病毒要测滴度,根据滴度决定转染目的细胞的病毒量。转染目的细胞1-2天后加抗生素筛选得到稳定细胞株。

13. 细胞共培养

共培养体系主要用于诱导细胞向另一种细胞分化,诱导细胞自身分化,维持细胞功能和活力,对细胞增殖进行调控,促进早期胚胎的发育和提高代谢产物的产量。

13.1直接共培养

制备细胞悬液:分别消化细胞A和细胞B,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1-2遍,用含BSA的无血清培养基重悬,调整细胞密度。将两种细胞按照一定比例在同一培养皿中共同培养。显微镜下观察细胞形态变化和增殖情况。结果统计分析。

13.2间接共培养

将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。两种细胞联合培养,研究其中一种细胞分泌的因子对另一细胞性能的影响,此时选择小于3.0μm孔径,细胞不会迁移通过,将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。间接共培养范例:

观察在 Transwell小室环境下成骨样细胞与骨髓基质干细胞体外共培养及成骨样细胞定向诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的可行性。取乳兔成骨样细胞与兔骨髓基质干细胞接种共培养于Transwell小室内,成骨样细胞接种于培养板底层,骨髓基质干细胞接种于 Transwell膜内膜上作为实验组。以骨髓基质干细胞单独接种于Transwell 小室内,下层为基础培养液作为对照组。

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