凝胶迁移或电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)

凝胶迁移或电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)

概述:

凝胶迁移或电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

目的:

1.用于研究特定的转录因子以及转录因子所结合的顺式作用元件;

2.用于研究与蛋白质相结合的DNA序列的特异性;

3.评估突变对探针DNA与结合蛋白相互作用的影响;

4.用于研究DNA-foot printing。

原理:

通常将纯化的蛋白和细胞提取液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测如转录因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异), 和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

步骤:

使用Pierce生产的试剂盒,按照说明书操作。

1、寡聚核苷酸的标记

(1)冰上融化标记试剂盒所有试剂(TdT除外);

(2)使用前,用lxTdT reaction buffer稀释TdT贮液,工作浓度为2U/μl;

(3)按下表加入试剂(总体积50 μl):

UltraPure water                                  25 μl

5xTdT Reaction Buffer                     10 μl

Sample oligo DNA(l μl)                     5 μl (final concentration 100 nM)

Biotin-N4-CTP(5 μl)                          5 μl (final concentration 0.5 μM)

Diluted TdT(2U/μl )                           5 μl (final concentration 0.2U/μl)

(4)37C° 30min;

(5)加2.5μl 0.2 M EDTA终止反应;

(6)加50 μl氯仿:异戊醇(24:1)抽提TdT,剧烈震荡,高速离心,取上层水相;

(7)检测标记效率。

(8)互补连退火,退火后的用于EMSA分析或-20 C°冻存。

2、EMSA实验步骤

(1)配制电泳胶:丙烯酰胺的浓度为4-6%,100V电压预电泳;

(2)结合反应

按下列顺序加试剂(总体积20 μl):

UltraPure water                            dependent

10xBinding Buffer                           2 μl

Poly(dIdC)                                        l μl

Unlabeled taget DNA                   dependent

Protein Extract                                 3-5 μg

Biotin End-labeled Tagret                l μl (Final concentration 20 fM/μl)

Antibody                                           4 μg

(3)电泳

60V电压电泳,溴酚蓝前沿至胶的2/3处停止电泳;

(4)转膜

380 mA电流,转膜lh;

(5)检测

a37 C°融化Blocking buffer和4xWashing Buffer;

b加Blocking Bueffr,室温轻摇15 min;

c制备Conjugate/blocking buffer solution;

d倒出Blocking Buffer,加入Conjugate/blocking buffer solution,室温轻摇15min;

e制备lxWashing Buffer;

f将膜转入一干净的容器,用lxWashing Buffer洗涤4次,每次5min,室温轻摇;

g将膜转入一干净的容器,加substrate Equilibration Buffer,室温轻摇5min;

h制备substrate working solution(避光);

i取出膜,在纸巾上吸去多余液体,放入干净容器,加substrate working solution,放置5min;

j取出膜,在纸巾上吸去多余液体,用保鲜膜包好,不要有褶皱;

k暗室中曝光,照相。

流程图:

凝胶迁移或电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)

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